PCR产物直接测序的原理
原理：是来至于双脱氧链终止法——现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出：模板经过测序PCR反应后形成3'末端带有荧光标记（早期用同位素标记）的相差一个碱基的不同长度的产物，再根据每段DNA产物的电泳速度来检测整段DNA的序列。以上——手打——希望对你有帮助优点：一是操作易于标准化与自动化，因为它是一个单一的酶的反应过程，不依赖于生物体；二是通过一次测序反应就能确定样品中某个等位基因的顺序，而PCR产物克隆后测序时，样品顺序要在测定了数个克隆片段之后才能确定。因为只有这样，才能区别突变是基因组本来就有的，还是由于Tag聚合酶在PCR过程中错误掺入核苷酸引起的。
纯化的pcr产物测序需要什么样的要求
纯化的pcr产物测序需要的要求：
(1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；
(2）必须进行胶回收纯化；
(3）DNA纯度在1.6-2.0之间，浓度50ng/ul以上。
方法
(1) 在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer PCR-A，若需加入的Buffer PCR-A不足100μl，则加入100μl。
(2) 将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步骤⑴中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm离心1min。
(3) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl Buffer W1，5500rpm离心1min。
(4) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube 中，加入700μl 已加无水乙醇的Buffer W2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。
(5) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm离心1min。
(6) 连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30μl Eluent或去离子水（65℃预热）。 (7) 室温静置2min，14000rpm离心1min洗脱DNA。 (8) 取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。
